III 水環境における水質リスク評価に関する研究
研究期間：平成13年度～17年度
プロジェクトリーダー：水循環研究グループ上席研究員（水質） 田中宏明
研究担当グループ：水循環研究グループ（河川生態、水質）、材料地盤研究グループ（リサイクル）
1. 研究の必要性
近年、水を経由した微量化学物質や病原性微生物などの汚染によって、人の健康や野生生物の生態系への影響が懸念されている。このため、水環境における微量化学物質や病原性微生物の汚染状況の把握、汚染原因の究明、影響の評価、対策の必要性の判断、さらには必要に応じて対策の実施が求められている。
2. 研究の範囲と達成目標
本重点プロジェクト研究では、水環境に含まれるエストロゲン作用をもつ内分泌攪乱化学物質（以下「環境ホルモン」）、ダイオキシン類、および病原性微生物を対象として、その検出試験方法、影響評価方法を開発し、水環境での挙動を解明するとともに下水処理の効果を明らかにすることを研究の範囲とし、以下の達成目標を設定した。
(1) 環境ホルモン、ダイオキシン類の挙動の解明とホルモン作用の包括的評価指標の開発
(2) 環境ホルモン、ダイオキシン類の簡便な試験手法の開発
(3) 下水中の環境ホルモンが淡水魚に与える影響と下水処理場における処理効果の解明
(4) 下水汚泥の再利用などにおける病原性微生物のリスク評価手法の開発
3. 個別課題の構成
本重点プロジェクト研究では、上記の目標を達成するため、以下に示す研究課題を設定した。
(1) 都市排水由来の化学物質の水環境中での挙動に関する研究（平成13～17年度）
(2) ダイオキシン類の存在形態とモニタリング・分析手法に関する研究（平成12～14年度）
(3) 下水道における微量化学物質の評価に関する調査（平成13～17年度）
(4) 都市排水に含まれるエストロゲン様物質が魚類に及ぼす影響と指標化に関する研究（平成14～17年度）
(5) 病原性微生物の同定方法および挙動に関する研究（平成11～17年度）
このうち、平成14年度は(1)、(2)、(3)、(4)、(5)の5課題を実施している。
4. 研究の成果
(1) 環境ホルモン、ダイオキシン類の挙動の解明とホルモン作用の包括的評価指標の開発
環境ホルモンのうち、女性ホルモン（エストロゲン）作用による水環境に棲息する野生生物、特に魚類への影響が懸念されるエストロゲン、ノニルフェノール類(NPs)を対象に水中での挙動を解明するため、LC/MS/MSやGC/MSなどの機器を用いた分析方法の開発に取り組み、17βエストラジオール(E2)、エストロン(E1)、エチニルエストラジオール(EE2)、ノニルフェノール(NP)、ノニルフェノールエトキシレート(NPEO)、ノニルフェノールエトキシ酢酸(NPEC)に加えて、平成14年度には水試料のエストロゲン包合体と底泥試料のノニルフェノキシ酢酸類の分析方法に関する検討を行った。この結果、LC/MS/MSを用いて水中のエストロゲン抱合体の測定が開発されたが、環境試料では回収率が低い場合があり、さらに改良が必要である。また前処理法の改良により従来法と比較して底質中のNPEC類の回収率の向上を確認した。
エストロゲンおよびノニルフェノール類の水環境中での挙動を理解するため、手賀沼とそこに流入する大津川および多摩川において現地調査を行った。エストロゲンは11月にはE1が多かったが、2月にはE2が多い場合があった。NPEOは、エチレン鎖が1～4と8～10の2つのピークを持っていたが、NPECはNP2ECにピークを持つ分布であった。多摩川の河川水のエストロゲン様活性は夏季流下とともに減少していたが、冬季は変化が見られなかった。また、手賀沼の堆積底泥は、流域のエストロゲン､NPsの排出機構の変遷に伴う特徴的な分布が認められ、E1やNP、NPEOが底質中では長期にわたって保存されていること、底質中はNPとNPEOがほとんどで、NPECは少なく、この比率は深さとともに大きくは変化していないことが分かった。今後、現地調査の蓄積とともに、現場や室内での実験により、エストロゲン及びNPsの水域での挙動の理解を進める。
下水処理場の流入下水と処理水を対象に、固相カラムと異なる極性をもつ溶媒を用いた極性分画手法を検討し、下水および下水処理水のもつエストロゲン活性の由来推定を試みた。その結果、流入下水のエストロゲン活性は低極性から高極性まで広く検出されたが、17β-エストラジオール、エストロン、ノニルフェノールの寄与が大きいことが判明した。一方、しかし、E1、E2、NPで説明できないエストロゲン活性も分画成分が存在していることが確認された。また下水処理水のエストロゲン活性はE1、E2に由来する分画でほとんど説明できることが明らかとなった。今後、由来推定がさらに明確化できる分画手法の改良を行うとともに、データの蓄積を図る。
(2) 環境ホルモン、ダイオキシン類の簡便な試験手法の開発
環境ホルモンのうち、エストロゲンを対象に、免疫抗体による物質識別と酵素標識による定量化を行うELISA(enzyme-linked immuno-sorbent
assay)による簡易分析方法を民間と共同研究している。これまで検討してきたE2測定用ELISAの環境試料中の測定妨害物質除去の前処理方法の開発に続き、新たに開発されたE1を簡便に測定するELISAキットについて下水試料に適用するための前処理の改善方法を検討した。C18固相カラムからの溶出にジクロロメタンを用いる場合とさらにフロリジル固相抽出＋アミノプロピル固相抽出でクリーンアップする場合を複数の下水処理場流入下水と処理水を用いて比較した。流入下水では、前者はLC/MS/MS法に比べて過大となるが、後者はLC/MS/MS法の1.5倍以内に押さえられる良好な結果を得た。二次処理水試料については両者ともLC/MS/MS法に比較的近い値であった。両者には採水時でのアスコルビン酸による固定化方法後があり、今後さらに検討を続け、効果の確認を行う予定である。
底質中のダイオキシン類の分析の迅速化を目的として、乾燥、抽出工程の迅速化に関する比較検討を行った結果、高速溶媒抽出法(PFE)の適切な抽出条件を選定することで、比較的短時間の操作で、公定法より高めの分析結果を示すが、概ね簡易測定に適する技術が開発された。全国の河川底質を用いて、2つの酵素標識免疫抗体（ELISA）やAhリセプターバイデイングアッセイ(AhR)を用いた簡易分析方法を検討した。各測定キットの異性体ごとの交差率、検出下限性などの特徴を整理し、河川底質に含まれるダイオキシン類の異性体構成を検討した結果、各キットによる測定値(DEQ)は、底質に含まれる毒性換算係数（TEF）をもつ異性体を過大あるいは過小に評価することが予測された。河川底質試料を実際に測定したDEQもほぼその傾向を示したが、予想される値よりもさらに過大な結果を示す場合があり、精製方法が重要であることが分かった。また、同一試料を用いた、抽出、精製法とELISAやAhR、その他の機器測定系を組み合わせた測定系の比較を行った。この中では、四重極GC/MSを用いて測定する方法が比較的良い結果が得られたが、汚染地点での高い存在量とTEFを示す異性体を考慮した簡易分析法の選定が重要であることが示唆された。また、公定法であるソックスレー抽出とPFE抽出後、ELISA法およびAhRを測定した場合、後者の方が改善される場合があった。今後、さらに多くの試料での検討が必要であり、汚染現場での適用性を検討する研究を新たに行い、実用化に向けて開発を行う必要がある。
(3) 下水中の環境ホルモンが淡水魚に与える影響と下水処理場における処理効果の解明
わが国の河川でエストロゲン様物質による魚類影響が生じているのかは明確ではないため、河川等の環境中で生じている魚類影響を確かめその原因を突き止めるために、魚類の曝露試験をおこなう必要がある。下水処理水を対象としたコイ曝露試験の結果、雄コイにビテロジェニン（VTG）誘導がみられる場合があると確認されたが、その影響が見られたのは4回行った実験では1回のみであった。この原因として、下水処理水に含まれるエストロゲン様物質が作用する他に、体内のエストロゲン誘導を起こす薬物代謝酵素活性を増大させる物質の存在が関与している可能性があるので、その一種であるEROD（Ethoxy
resorufin-o-deethylase）を下水処理水での暴露系されたコイの肝臓で測定した結果、脱塩素水道水で飼育した対照系よりも高いEROD誘導が認められた。
現地での魚類曝露試験には、生理学的知見が分かっており、由来が明確なヒメダカを用いることが有利であることが分かった。そこで生理的反応を考慮できるように、試験条件を制御できる現場型魚類曝露試験システムを開発し、予備試験に着手した。多摩川での国土交通省の水質監視施設2地点で成魚を2週間暴露した結果では、水中のエストロゲン活性、エストロゲン様物質は低濃度であり、雄ヒメダカのVTGはすべて定量下限値以下であり、影響を検出することはできなかった。今後は、よりエストロゲン活性の高い地点や下水処理水での暴露路実験を行うとともに、感受性の高い胚から曝露を開始し、次世代までの影響をみる必要があると考えられる。
下水処理場の実態調査を行った結果、E2、E1は、最初沈殿池流入水（初沈流入水）と初沈流出水の値を比べるとほぼ同じ値を示しており最初沈殿池内での分解はほとんど見られないが、曝気槽内に入るとE2は徐々に減少し、曝気槽のほぼ中間で検出下限値未満となるのに対し、E1は曝気槽内に入るとすぐ初沈流出水より増加した後、徐々に減少することが分かった。また、流入水、二次処理水中のエストロゲン抱合体の濃度は、遊離体の濃度に比べ数倍から100倍程度高いことが分かったが、分析における回収率に課題がありさらに検討が必要である。
一方、NPsについては、NP、NPEOは曝気槽では、初沈流入水、初沈流出水の1/10～1/100程度に濃度が減少し、NPECは逆に2倍以上に濃度が増加した。NPEOは、エチレン鎖が1～12のほぼ均等であるものが、曝気槽ではエチレン鎖5以上が消失し、1～4で構成されていた。NPECは、エチレン鎖は2～3をピークとしてその他の1～10は均等に存在していた。曝気槽ではエチレン鎖5以上が減少し、逆に4以下が増加し、1～4がほとんどを占めた。これらの結果からNPEOは、エチレン鎖が短鎖化する場合と、NPECに形態を変えて短鎖化を受ける場合があり、下水処理が進むに連れてNPEC濃度が増加する理由は、NPEOとNPECの分解速度に違いがあることが考えられる。エチレン鎖5以上のNPECに顕著な濃度増加が認められないことから、NPEOからNPECへの形態変化は、主にエチレン鎖5以下で進行している可能性がある。今後、エストロゲン抱合体を中心にさらに下水処理場でのデータ集積を図るとともに、分解経路、分解速度の室内実験を行う予定である。
(4) 下水汚泥の再利用などにおける病原性微生物のリスク評価手法の開発
14年度は、Cryptosporidium の18SリボソームRNA遺伝子（18SrDNA）をReal Time PCRにより検出するためのPrimerとProbeを設計した。本PrimerとProbeを用いた場合、ヒトに感染性を有するC.parvumの他に、C.meleagridis、C.felisが検出される可能性がある。Cryptosporidiumオーシストの希釈系列試料を用いた結果から、Real
Time PCR法では、18SrDNAを標的とすることによりCryptosporidiumオーシスト数約1個から定量検出可能となり、これまでのHeat
Shock Proteinをターゲットした場合よりも大幅に改良された。河川水、下水にCryptosporidiumオーシストを添加した試料を用いた検討結果から、この方法は河川水、下水中のCryptosporidiumオーシストのReal
Time PCR検出も可能であり、その検出感度はオーシストが顕微鏡観察で2個以上確認できるレベルであれば、可能であり、ほぼ顕微鏡観察法と同程度であった。
Cryptosporidium オーシストを20℃水道水、海水、河川水中に1ヶ月保存し、Cryptosporidium
オーシストの感染性を乳のみマウス感染試験によって確かめた。この結果、Cryptosporidiumオーシストは、20℃の水道水、海水、河川水中に1ヶ月間保存した後でも、感染能力を有していることがわかった。また腸管から回収されるオーシスト数およびマウス感染確率から感染性の消失に与える影響を考察すると、海水、水道水、河川水の順で腸管から回収されるオーシストの数、および感染確率が低下しており、Cryptosporidium
オーシストの感染性は、海水、水道水、河川水の順番で消失することが明らかとなった。今後は、CryptosporidiumオーシストのReal
Time PCR検出および環境中で感染性についてデータ蓄積と精度向上を図るとともに、病原ウイルスの迅速・簡便検出の開発に重点を置く予定である。
3.1 都市排水由来の化学物質の水環境中での挙動に関する研究
研究予算：運営費交付金（一般勘定）
研究期間：平13～平17
担当チーム：水循環研究グループ（水質）
研究担当者：田中宏明、小森行也、佐々木稔
【要旨】
近年、水環境中での界面活性剤の分解物質や人畜由来のホルモンなどによって野生生物の内分泌攪乱が生じる場合があると報告されている。こうした内分泌攪乱物質について、発生源や排出源などで効率的なリスク削減対策を講じるためには、これら物質の水、底泥などの水環境での挙動を把握し、水域に与える影響を把握することが必要である。本プロジェクトでは、都市排水由来のこれら内分泌攪乱物質の、河川水・底質中などにおける調査分析手法の開発、また水環境中での分解・生成といった変化現象の把握を目的としている。
14年度は、底泥試料を対象としたノニルフェノキシ酢酸の分析法に関する検討を行い、GC/MSによる分析手法を改良することで回収率を向上させた。また、内分泌攪乱物質の水環境中での挙動を把握するため、湖沼及び河川における実態調査を行い、都市排水由来の流入状況、河道における変化や底泥への蓄積状況を明らかにした。
キーワード：NP、NPEO、NPEC、エストロゲン、内分泌攪乱物質、河川水、底泥、挙動
3.2 ダイオキシン類の存在形態とモニタリング・分析手法に関する研究（1）
研究予算：運営費交付金（一般勘定）
研究期間：平12～平14
担当チーム：水循環研究グループ（水質）
研究担当者：田中宏明、小森行也、岡安祐司
【要旨】
平成12年1月15日より「ダイオキシン類対策特別措置法」が施工され、ダイオキシン類汚染に対して適切な対応を取ることが必要となった。河川管理においても河川水・底質のモニタリングは重要であるが、調査試料は膨大でありこれらに対応するため安価でしかも短時間で結果が得られる簡易な分析手法が必要となっている。
水や底質中のダイオキシン類を従来法と比較して簡易で迅速に、試料の前処理から測定まで行う分析技術の開発について民間との共同研究を実施している。また、現在、専門家が実施しているダイオキシン類の分析についての精度管理手法をパターン化、システム化し、比較的簡単に判定できる精度管理手法の検討を行った。
キーワード：ダイオキシン類、底質、モニタリング、簡易分析、精度管理
3.3 ダイオキシン類の存在形態とモニタリング・分析手法に関する研究（2）
研究予算：運営費交付金（一般勘定）
研究期間：平12～平14
担当チーム：材料地盤研究グループ（リサイクル）
研究担当者：鈴木 穣、南山瑞彦、落 修一
【要旨】
近年、極微量でも高い毒性を持つとされているダイオキシン類による汚染が全国的に大きな問題となっており、建設事業に対応した、迅速に結果が得られる底質中のダイオキシン類の分析手法の検討、開発が求められている。14年度は、前年度に引き続き、底質試料中のダイオキシン類の分析の迅速化を目的として、乾燥、抽出工程の迅速化に関する比較検討を行った。その結果、高速溶媒抽出法（PFE法）の応用による乾燥、抽出工程の迅速化が可能であることが明らかとなった。
キーワード：ダイオキシン類、底質、分析、乾燥、抽出、迅速化
3.4 ダイオキシン類の存在形態とモニタリング・分析手法に関する研究（3）
研究予算：運営費交付金（一般勘定）
研究期間：平13～平14
担当チーム：水循環研究グループ（河川生態）
研究担当者：尾澤卓思、伊藤弘之
【要旨】
本研究では、底質や水中に含まれるダイオキシン類を簡易に調査またはモニタリングする手法を提案するとともに、溶出実験を行い覆砂の有するダイオキシン類溶出抑制効果を評価することにより、底質や水中におけるダイオキシン類の存在形態について検討した。その結果、底質中では強熱源量等の有機物指標が底質ダイオキシン類と、底質の巻き上げが卓越する水中ではSSが水質ダイオキシン類と良好な相関関係を有し、代替指標になり得ること、覆砂は主に懸濁態のダイオキシン類の水中拡散を抑制することで、溶出抑制効果を発揮することが分かった。
キーワード：ダイオキシン類、底質、水質、簡易調査、簡易モニタリング、覆砂
研究予算：受託経費（下水道事業調査費）
研究期間：平13～平17
担当チーム：水循環研究グループ（水質）
研究担当者：田中宏明、小森行也、岡安祐司
【要旨】
下水道は、生活排水や一部の事業場排水を受入れ、処理を行い環境中に排出しているが、現在、下水中には、内分泌かく乱作用が懸念される微量化学物質が含まれている可能性が指摘されており、これらの微量化学物質の環境への排出量の削減および下水処理水の環境安全性を確保することが求められている。
本調査は、下水道に流入する可能性のある内分泌かく乱作用が懸念される微量化学物質の評価手法の開発を目的とし、(1)微量化学物質の検出方法の簡易化、迅速化、(2)微量化学物質の下水道での挙動把握を行う。
キーワード：内分泌かく乱物質、エストロゲン、ノニルフェノール類、ELISA法
3.6 都市排水に含まれるエストロゲン様物質が魚類に及ぼす影響と指標化に関する研究
研究予算：競争的資金（地球環境保全等調査研究費）
研究期間：平14 ～ 平17
担当チーム：水循環研究グループ（水質）
研究担当者：田中宏明、小森行也、玉本博之
【要旨】
本研究は、下水処理水やその放流先都市河川において、エストロゲン様物質の影響によって発生すると考えられる魚類の雌性化について、その影響の有無を確認するとともに、水試料の分画法と遺伝子組み換え酵母によるエストロゲン活性を組み合せることによって、このエストロゲン活性を魚類の雌性化との関係を検討する指標としての利用性を評価するものである。本年度の成果として、以下のことが明らかとなった。(1)下水処理水を対象としたコイ曝露試験を実施した結果、雄コイに影響がみられる場合のあることが確認されたが、その影響は魚類本来の生理学的反応に左右される可能性が考えられた。(2)都市河川等での魚類曝露試験では、魚類の生理的反応を考慮できるように、試験条件を制御できる試験水槽システムが必要と考えられた。そこで、この条件を満たす現場型魚類試験システムを開発し、予備試験に着手した。(3)極性による分画手法を適用して、下水処理水のもつエストロゲン様活性の性状把握を試みた結果、流入下水のエストロゲン様活性は低極性から高極性まで広く検出され、17β-エストラジオール、エストロン、ノニルフェノールの寄与が大きいことが判明した。
キーワード：都市排水、コイ、現場型メダカ曝露試験システム、エストロゲン活性、極性分画法
研究予算：運営交付金（一般勘定）
研究期間：平11～平17
担当チーム：材料地盤研究グループ（リサイクル）
研究担当者：鈴木穣、北村友一、中村みやこ
【要旨】
下水・河川水中のCryptosporidiumオーシストを簡便かつ迅速に検出するため、Real Time PCR法によるCryptosporidiumの定量検出方法の提案と河川水、海水、水道水中でのCryptosporidiumオーシストの感染能力の消長を明らかにした。Real
Time PCR法によるCryptosporidiumオーシストの検出では、18SrDNAを標的遺伝子とすることにより、オーシスト数約1個から定量検出可能となった。20℃の河川水、海水、水道水中に1ヶ月程度保存した後でも、オーシストの感染能力は維持されていた。
キーワード：Cryptosporidium、Real Time PCR法、感染能力
