III 水環境における水質リスク評価に関する研究
研究期間：平成13年度～17年度
プロジェクトリーダー：水循環研究グループ上席研究員（水質） 田中宏明
研究担当グループ：水循環研究グループ（河川生態、水質）、材料地盤研究グループ（リサイクル）
1. 研究の必要性
近年、水を経由した微量化学物質や病原性微生物などの汚染によって、人の健康や野生生物を含む生態系への影響が懸念されている。このため、水環境における微量化学物質や病原性微生物の汚染状況の把握、汚染原因の究明、影響の評価、対策の必要性の判断、さらには必要に応じて対策の実施が求められている。
2. 研究の範囲と達成目標
本重点プロジェクト研究では、水環境に含まれるエストロゲン作用をもつ内分泌攪乱化学物質（以下「環境ホルモン」）、ダイオキシン類、および病原性微生物を対象として、その検出試験方法、影響評価方法を開発し、水環境での挙動を解明するとともに下水処理の効果を明らかにすることを研究の範囲とし、以下の達成目標を設定した。
(1) 環境ホルモン、ダイオキシン類の挙動の解明とホルモン作用の包括的評価指標の開発
(2) 環境ホルモン、ダイオキシン類の簡便な試験手法の開発
(3) 下水中の環境ホルモンが淡水魚に与える影響と下水処理場における処理効果の解明
(4) 下水汚泥の再利用などにおける病原性微生物のリスク評価手法の開発
3. 個別課題の構成
本重点プロジェクト研究では、上記の目標を達成するため、以下に示す研究課題を設定した。
(1) 都市排水由来の化学物質の水環境中での挙動に関する研究（平成13～17年度）
(2) ダイオキシン類の存在形態とモニタリング・分析手法に関する研究（平成12～14年度）
(3) 下水道における微量化学物質の評価に関する調査（平成13～17年度）
(4) 都市排水に含まれるエストロゲン様物質が魚類に及ぼす影響と指標化に関する研究（平成14～17年度）
(5) 病原性微生物の同定方法および挙動に関する研究（平成11～17年度）
このうち、平成15年度は(1)、(3)、(4)、(5)の4課題を実施している。
4. 研究の成果
(1) 環境ホルモン、ダイオキシン類の挙動の解明とホルモン作用の包括的評価指標の開発
「都市排水由来の化学物質の水環境中での挙動に関する研究」において、昨年度開発したエストロゲン抱合体の測定法の問題点を検討した結果、グルクロン酸抱合体や一部の硫酸抱合体の水試料への添加回収率が、低い場合があることが分かった。エストロゲン抱合体が、遊離体に比べ下水処理水にも無視できないほど残留していることから、エストロゲンの環境での挙動の理解を進めるためには、抱合体の分析の改良をさらに続ける必要がある。
手賀沼の底泥表層のエストロゲンやノニルフェノール(NP)類の平面分布を調査した結果、ノニルフェノールエトキシレート(NPEO)やノニルフェノールエトキシ酢酸(NPEC)が流入河川の河口で最大となりその後減少するのと異なり、NPは湖沼の流下方向に従って濃度が高くなることが判明した。水中の藻類の増殖とNP濃度の流下方向への増加が見られることから、藻類などへの吸着性の相違が分布の違いに関連していることが示唆される。
手賀沼流入河川河口地先で底泥の鉛直分布を調べると、エストロン(E1)の中層付近での蓄積が見られたが、17βエストラジオール(E2)は、ほとんど検出されなかった。堆積年代の測定を行ったところ、流域での人口増加や流域下水道の供用時期と濃度分布の変化が見られる時期とが符号することが分かった。
三春ダムの前貯水池の堆積底泥の上層・中層・下層の試料にE2を添加し、振とう装置を用いた生物分解試験を行った。この結果、E2は嫌気、好気とも生分解による割合が吸着よりも大きいこと、その温度依存性が大きいこと、深層部より表層部の底泥になるほど分解速度が大きいこと、好気下の方が嫌気下よりも分解速度が大きくなることが明らかとなった。また、E2が分解することで生成したE1は、好気下では次第に減少していくが、嫌気下では一旦減少した後、再び増加する現象が見られ、好気下でのアンモニア性窒素、嫌気下での硝酸性窒素の添加によってE2の分解速度の増加が見られた。これらのことは、E1、E2の分解過程が好気、嫌気的な環境、さらにアンモニアや硝酸の存在下で異なる可能性を示唆している。「都市排水に含まれるエストロゲン様物質が魚類に及ぼす影響と指標化に関する研究」において、これまで固層カラムで極性分画したよりも、分画段数の高いHPLCによる方法を開発し、NP、遊離体および抱合体のエストロゲンを分画することが可能となった。この方法を用いた下水および下水処理水のエストロゲン活性の由来を評価した結果、いずれの試料についてもE1およびE2の寄与が大きいことが改めて確認された。
(2) 環境ホルモン、ダイオキシン類の簡便な試験手法の開発
「下水道における微量化学物質の評価に関する調査」において、 下水、下水処理水のE2測定用ELISA法の前処理法として、(1)冷蔵保存、C18固相抽出（ジクロロメタン溶出） (2)採水時にアスコルビン酸による固定化、冷蔵保存、C18固相抽出＋フロリジル固相抽出＋アミノプロピル固相抽出の２つの方法を検討した。異なる前処理でのELISA法による測定値を比較した結果、下水、下水処理水とも、いずれの方法でも明確な差はなかったことから、この方法では妨害物質の除去が不十分であることが判明した。なお、ELISA法による測定結果は、LC/MS/MS法による測定結果の1.5倍程度、二次処理水では2倍程度以上であった。
(3) 下水中の環境ホルモンが淡水魚に与える影響と下水処理場における処理効果の解明
「都市排水に含まれるエストロゲン様物質が魚類に及ぼす影響と指標化に関する研究」において、雄の成魚のヒメダカを用いたE2及びE1の14日間の暴露実験を行い、肝臓中のビテロジェニン（VTG）の誘導をエンドポイントする最小影響濃度(LOEC)と最大無影響濃度(NOEC)の暴露期間による影響の関係を得た。この結果、E2のLOECは4あるいは7日間暴露では13ng/Lであったが、14日間暴露では5ng/Lであった。一方、E1のLOECは暴露期間が3日間以上であれば、80ng/Lであり、E2の誘導ポテンシャルの0.18～0.26程度であった。また、暴露期間が2週間までは、同一のエストロゲン濃度でもVTG誘導が起こりやすくなることが分かった。
都市排水が流入している2つの河川の国土交通省の水質監視施設2地点で成魚を2週間暴露した。河川水がエストロゲン活性で5ng/Lを超える地点で飼育された成魚の雄メダカから肝臓中VTGが検出されたが、他の地点では、エストロゲン活性が低く、雄ヒメダカのVTGは検出できなかった。
「下水道における微量化学物質の評価に関する調査」において、20箇所の下水処理場において遊離体のエストロゲン及びエストロゲン抱合体の実態調査を実施した。この結果、これまで報告例が少ないグルクロン酸や硫酸抱合体の流入下水、二次処理水中の存在濃度を明らかにしたが、流入下水、二次処理水中のE1、E2、エストロン(E3)の遊離体のエストロゲンよりも多量に存在していることが明らかになった。また、エストロゲン遊離体は、下水処理で効果的に除去されているが、抱合体の一部は下水処理を受けることにより増加しており、流入下水中には測定対象となっていない形態のエストロゲン抱合体の存在が示唆された。
(4) 下水汚泥の再利用などにおける病原性微生物のリスク評価手法の開発
「病原性微生物の同定方法および挙動に関する研究」において、Cryptosporidiumオーシストを添加した下水等の試料の濃縮・分離操作を行い、昨年度設計したPrimerとProbeを用いてReal Time PCR法によるオーシストの定量を行った結果、オーシストの回収率は検鏡観察で得られた値と同程度であり、高濃度域においてもReal Time PCR法は検鏡法と同程度の検出感度を持つと考えられた。また、ファージを用いてウイルスの濃縮・誘出法を検討した結果、60%程度以上の回収率が得られたのは、流入下水については超遠心法およびPEG沈殿法、二次処理水・砂ろ過水についてはセルロース吸着・凝集法であり、試料水ごとの適した濃縮・誘出方法が明らかとなった。さらに、低濃度域のウイルスについてReal Time PCR法の検出感度を検討した結果、最小検出感度は5～10コピーであった。
個別課題の成果
3.1 都市排水由来の化学物質の水環境中での挙動に関する研究
研究予算：運営費交付金（一般勘定）
研究期間：平13～平17
担当チーム：水循環研究グループ（水質）
研究担当者：田中宏明，小森行也，津森ジュン
【要旨】
本研究は，界面活性剤の分解物質や人畜由来のホルモンなど都市排水由来の内分泌攪乱物質に関し，河川水・底質中などにおける調査分析手法の開発，また水環境中での分解・生成といった変化現象の把握を目的としている。
平成15年度は，水環境中に与える影響が大きいと考えられる下水を対象としてエストロゲン抱合体の分析法の開発と，河川及び湖沼の水中，底質中におけるエストロゲン，ノニルフェノール類の実態調査と底質中におけるエストロゲンの挙動に関する室内実験を行い，次のことが明らかになった。
1）LC/MS/MSによるエストロゲン抱合体の分析法を開発した。下水に対するエストロゲン遊離体及びその抱合体の添加回収試験の結果，遊離体の回収率は94～120%と良好な結果が得られたが，抱合体については回収率が低かった。
2）手賀沼で水中，表層底泥中のエストロゲン，ノニルフェノール類の水平分布を調査した。NPは流下方向で増加傾向にあり，一方，エストロゲン，NPEO，NPECは流入河川河口付近で最大となり流下方向では低下傾向にあった。これは，内部生産により増加した藻類など懸濁物質への吸着，沈降機構が寄与しているものと考えられた。
3) 三春ダム前貯水池の底泥にE2を添加し，振とう装置を用いた生物分解試験を行った。底泥位置や水温，好気嫌気などの実験条件による相違を検討した結果，中層、下層に比べて上層底泥の方が，E2の分解が早く、分解速度係数が著しく大きかった。
キーワード：NP，NPEO，NPEC，エストロゲン，河川水，底泥，挙動，生分解
研究予算：受託経費（下水道事業調査費）
研究期間：平13～平17
担当チーム：水循環研究グループ（水質）
研究担当者：田中宏明、小森行也、岡安祐司
【要旨】
平成15年度は、下水道に流入する可能性のある内分泌かく乱作用が懸念される微量化学物質の評価手法の開発を目的とし、(1)微量化学物質の検出方法の簡易化、迅速化、(2)微量化学物質の下水道での挙動把握を行った。
下水試料中の17b-estradiol 測定用ELISA法における、交差反応及び妨害物質を除去する簡易な前処理法の開発に関しては課題が残った。また、下水処理場の流入下水、二次処理水におけるエストロゲンの遊離体及び抱合体の実態を把握した。さらに、ノニルフェノールポリエトキシレートの、連続系活性汚泥処理実験では、DO1.0mg/L程度の好気工程で、ノニルフェノール生成が観察され、この反応にはDO濃度が影響することが示唆された。
キーワード：内分泌かく乱物質、エストロゲン、ノニルフェノール類、ELISA法、下水処理
3.3 都市排水に含まれるエストロゲン様物質が魚類に及ぼす影響と指標化に関する研究
研究予算：競争的資金（地球環境保全等調査研究費）
研究期間：平14 ～ 平17
担当チーム：水循環研究グループ（水質）
研究担当者：田中宏明、小森行也、宮島潔
【要旨】
本研究は、下水処理水やその放流先都市河川において、エストロゲン様物質の影響によって発生すると考えられる魚類の雌性化について、その影響の有無を確認するとともに、水試料の分画法と遺伝子組み換え酵母によるエストロゲン活性測定法を組み合せることによって、このエストロゲン活性を魚類の雌性化との関係を検討する指標として、利用性を評価するものである。本年度の成果として、以下のことが明らかとなった。
(1) メダカ肝臓中にビテロジェニン（VTG）誘導が生じることをエンドポイントとした場合、17β-エストラジオール（E2）のメダカへの最小作用濃度は、14日間曝露の場合に5.0ng/L と考えられた。その一方、曝露期間が2および7日間の場合では、最大無作用濃度が同じく5.0ng/Lと考えられた。河川等の水環境において、エストロゲン濃度が低くても曝露期間が長くなるとエストロゲン作用を受けたか否かを評価できる可能性が示唆された。
(2) メダカに及ぼすエストロン（E1）の最小作用濃度は、3、7および14日間の曝露期間とも79.5ng/L、最大無作用濃度は31.6ng/Lであった。E1の作用はE2の0.18～0.26倍と推定された。
(3) 都市排水を対象に現地メダカ曝露試験を14日間実施し、エストロゲン活性（E2換算値）が上記の最小作用濃度を越えている地点では、雄メダカにエストロゲン作用が認められることが確認された。
(4) 分解能の高い高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による水試料の分画法を検討し、エストロゲン類およびそれらの硫酸抱合体化合物を分離することが可能となった。また、流入下水のエストロゲン作用として、エストロンの寄与が大きいことが判明した。
キーワード：都市排水、メダカ、現地魚類曝露試験、エストロゲン活性、極性分画法
研究予算：運営費交付金（一般勘定）
研究期間：平11～平17
担当チーム：材料地盤研究グループ（リサイクル）
研究担当者：鈴木穣、諏訪守、陶山明子
【要旨】
下水試料中のCryptosporidiumオーシストを簡便かつ迅速に検出するため、Real Time PCR法によるCryptosporidiumの定量検出方法の適用性について評価するとともに、濃縮・分離操作および下水性状の違いが検出感度に及ぼす影響について検討を行った。その結果、Real Time PCR法は顕微鏡観察と比較して、高濃度域においても同程度の検出感度であると考えられたが、試料中の有機物濃度の違いによる影響や濃縮・分離操作により回収効率の損失があるため、改善策を講ずる必要があることが明らかになった。ウイルスの検出では、下水試料に適した濃縮法について検討を行い、流入下水では、超遠心処理法やPEG沈殿法により約60％、二次処理水、砂ろ過水試料ではセルロース吸着･凝集法により約60～100％のウイルス回収率が得られることが明らかとなった。
キーワード：Cryptosporidium、ウイルス、Real Time PCR法
