III 水環境における水質リスク評価に関する研究
研究期間：平成13年度～17年度
プロジェクトリーダー：水循環研究グループ上席研究員（水質） 鈴木穣
研究担当グループ：水循環研究グループ（水質）、材料地盤研究グループ（リサイクル）
1. 研究の必要性
近年、水を経由した微量化学物質や病原性微生物などの汚染によって、人の健康や野生生物を含む生態系への影響が懸念されている。このため、水環境における微量化学物質や病原性微生物の汚染状況の把握、汚染原因の究明、影響の評価、対策の必要性の判断、さらには必要に応じて対策の実施が求められている。
2. 研究の範囲と達成目標
本重点プロジェクト研究では、水環境に含まれるエストロゲン作用をもつ環境ホルモン、ダイオキシン類、および病原性微生物を対象として、その検出試験方法、影響評価方法を開発し、水環境での挙動を解明するとともに下水処理の効果を明らかにすることを研究の範囲とし、以下の達成目標を設定した。
(1) 環境ホルモン、ダイオキシン類の挙動の解明とホルモン作用の包括的評価指標の開発
(2) 環境ホルモン、ダイオキシン類の簡便な試験手法の開発
(3) 下水中の環境ホルモンが淡水魚に与える影響と下水処理場における処理効果の解明
(4) 下水汚泥の再利用などにおける病原性微生物のリスク評価手法の開発
3. 個別課題の構成
本重点プロジェクト研究では、上記の目標を達成するため、以下に示す研究課題を設定した。
(1) 都市排水由来の化学物質の水環境中での挙動に関する研究（平成13～17年度）
(2) ダイオキシン類の存在形態とモニタリング・分析手法に関する研究（平成12～14年度）
(3) 下水道における微量化学物質の評価に関する調査（平成13～17年度）
(4) 都市排水に含まれるエストロゲン様物質が魚類に及ぼす影響と指標化に関する研究（平成14～17年度）
(5) 病原性微生物の同定方法および挙動に関する研究（平成11～17年度）
このうち、平成16年度は(1)、(3)、(4)、(5)の4課題を実施している。
4. 研究の成果
本重点プロジェクト研究の個別課題の成果は、以下の個別論文に示すとおりである。なお、「２．研究の範囲と達成目標」に示した達成目標に関して、平成16年度に実施してきた研究について要約すると以下のとおりである。
(1) 環境ホルモン、ダイオキシン類の挙動の解明とホルモン作用の包括的評価指標の開発
本達成目標は、環境ホルモン等の分析方法を開発して水環境中での挙動を解明するとともに、ホルモン作用を示す物質と包括的評価指標の関係を明らかにすることによって包括指標の開発を行うものである。
平成16年度は、「都市排水由来の化学物質の水環境中での挙動に関する研究」において、排水・環境中の実態が未解明であるエストロゲン・グルクロン酸抱合体の分析法の開発，ノニルフェノール類の湖沼における実態調査と挙動シミュレーションモデルの構築，エストロゲンの湖沼における分解速度の測定を行った。その結果は、以下に示すとおりである。
1) エストロゲンのグルクロン酸抱合体の分析法において，前処理操作を簡易化して抱合体の分解を抑制することにより，添加回収率が二次処理水では87～120%、流入下水では60～110%と向上し，信頼性の高い方法が確立できた。
2) ノニルフェノール（NP）類の湖沼での挙動を、手賀沼を対象として調査したところ、水質濃度は湖内流下方向に向かって低下するが、底質濃度は逆の傾向を示した。また，NP類の生分解速度や吸着平衡係数を別途実験により求め，挙動シミュレーションモデルを構築したが，これにより，湖水におけるNP類濃度の構成および分布の傾向が再現できた。
3) 17βエストラジオールの湖沼における分解速度を、三春ダム前貯水池を対象として調査したところ、分解速度は表層底泥が中層や下層底泥よりも，また，好気条件下が嫌気条件下よりも大きかった。なお、SS量当たりの分解速度で見ると，水相は底泥相の2倍の大きさとなっていた。
(2) 環境ホルモン、ダイオキシン類の簡便な試験手法の開発
本達成目標は、公定法等に比べて簡便で、かつ所期の精度で環境ホルモン等が測定できる手法の開発を行うものである。
平成16年度は、「下水道における微量化学物質の評価に関する調査」において、下水試料中のEstroneおよび17β-estradiol 測定用ELISA法の精度向上方策を検討した。その結果は、以下に示すとおりである。
1) ELISA法における交差反応及び妨害物質を除去するため、簡易な前処理法として、SS除去、ヒューミン分画の分離およびフミン酸分画の分離について検討したところ、特に生物処理を受ける前の段階の下水試料に関して、フミン酸分画の分離が効果的であることが明らかになった。
(3) 下水中の環境ホルモンが淡水魚に与える影響と下水処理場における処理効果の解明
本達成目標は、下水処理水等に対する魚類影響評価の試験系を開発し、これを用いて下水中の環境ホルモンが魚類雌性化に与える影響を評価するとともに、下水処理場における環境ホルモン物質の挙動を把握して、下水処理による環境ホルモン除去の効果を解明するものである。
平成16年度は、「都市排水に含まれるエストロゲン様物質が魚類に及ぼす影響と指標化に関する研究」において、魚類曝露試験装置の開発とこれを用いた都市河川水の影響評価を行い、「下水道における微量化学物質の評価に関する調査」において、下水処理によるエストロゲン、エストロゲン抱合体および合成エストロゲンの除去効果を評価した。その結果は、以下に示すとおりである。
1) 河川水質自動監視所に水温調節機能を有する魚類曝露試験装置を設置し、都市河川水の魚類影響評価を行ったところ、下水処理水が流入している地点では、エストロンを主体とするエストロゲン作用によって魚類影響が認められ、また、降水量等によるエストロゲン作用の変動に伴って魚類影響の程度も変動することが示された。
2) 膜分離を用いた好気的生物処理において、遊離体エストロゲンの除去は完全に行われたが、エストロゲン硫酸抱合体の除去には限界があったことから、好気条件下でのエストロゲン硫酸抱合体の難分解性が示された。
3) 合成エストロゲンのエチニルエストラジオール（EE2）の実態を下水処理場において調査したところ、流入水、処理水ともにEE2濃度は極微量であったことから、現時点で生物影響の可能性は小さいと考えられた。
(4) 下水汚泥の再利用などにおける病原性微生物のリスク評価手法の開発
本達成目標は、分子生物学的手法を用いて原虫やウイルスの迅速・高感度検出方法を検討するとともに、水環境中や下水処理過程での病原性微生物の挙動を解明することにより、病原性微生物のリスク評価手法を開発するものである。
平成16年度は、「病原性微生物の同定方法および挙動に関する研究」において、クリプトスポリジウムの感染能力評価法として細胞培養法を検討するとともに、分子生物学的手法を用いたウイルス検出法の改良を行った。その結果は、以下に示すとおりである。
1) クリプトスポリジウムの細胞培養法において、増殖状況を顕微鏡観察およびELISA法によって評価したところ、細胞培養法はマウスによる感染試験法と比較して迅速かつ簡易に測定が行えるが、測定値のばらつきが大きいことが課題であった。
2) Real-Time PCRによるウイルス検出法を検討するに当たり、セルロース・吸着凝集法およびポリエチレングリコール法によるウイルス濃縮法の最適化を行った。また、開発した手法により下水処理場におけるノロウイルスの実態を調査し、下水処理過程での除去率を求めた。
個別課題の成果
3.1 都市排水由来の化学物質の水環境中での挙動に関する研究
研究予算：運営費交付金（一般勘定）
研究期間：平13～平17
担当チーム：水循環研究グループ（水質）
研究担当者：鈴木穣、小森行也、津森ジュン
【要旨】
本研究は，界面活性剤の分解物質や人畜由来のホルモンなど都市排水由来の内分泌攪乱物質に関し，河川水・底質中などにおける調査分析手法の開発，また水環境中での分解・生成といった変化現象の把握を目的としている。
平成16年度は，手賀沼におけるノニルフェノール類の実態調査と挙動シミュレーションモデルの構築，分析法が未確立であり排水・環境中での実態が未解明であるエストロゲン・グルクロン酸抱合体についての分析法の開発，湖沼におけるエストロゲン挙動を把握するために三春ダム前貯水池等の水・底泥試料についてエストロゲン分解速度を測定し，次のことが明らかになった。
1) ノニルフェノール（NP）類の手賀沼内水質濃度は流下方向に従って低減するが、底質濃度は逆の傾向を示した。また，NP類の生分解速度や吸着平衡係数を別途実験により求め，挙動シミュレーションモデルを構築したが，これにより，湖水におけるNP類濃度の構成および分布の傾向が再現できた。
2) エストロゲンのグルクロン酸抱合体の分析法において，前処理操作を簡易化して抱合体の分解を抑制することにより，添加回収率が二次処理水では87～120%、流入下水では60～110%と向上し，信頼性の高い方法が確立できた。
3) 17βエストラジオールの分解速度は，表層底泥の方が中層や下層底泥よりも大きく，また，好気条件下の方が嫌気条件下よりも大きかった。SS量当たりの分解速度で見ると，水相は底泥相の2倍の大きさであった。
キーワード：ノニルフェノール類，エストロゲン，抱合体，湖沼，挙動，シミュレーションモデル
研究予算：受託経費（下水道事業調査費）
研究期間：平13～平17
担当チーム：水循環研究グループ（水質）
研究担当者：鈴木穣、小森行也、岡安祐司
【要旨】
平成16年度は、下水道に流入する可能性のある内分泌かく乱作用が懸念される微量化学物質の評価手法の開発を目的とし、(1)微量化学物質の検出方法の簡易化、迅速化、(2)微量化学物質の下水道での挙動把握を行った。
下水試料中のEstrone, 17b-estradiol 測定用ELISA法における、交差反応及び妨害物質を除去する簡易な前処理法として、SS除去、ヒューミン分画の分離およびフミン酸分画の分離について検討し、特に生物処理を受ける前の段階の下水試料に関しては、フミン酸分画の分離が効果的であることが推察された。
また、下水処理の好気工程におけるエストロゲンの遊離体及び抱合体の挙動特性をラボスケールの実下水を用いた連続実験装置において検討した。MLDO>5mg/L、SRT=60日という好気的生分解に有利な処理条件においては、遊離体エストロゲンの除去は完全に行われ、エストロゲン硫酸抱合体も減少を示したが依然、二次処理水に残留する結果となった。好気条件下では、エストロゲン硫酸抱合体の難分解性が強いことが明らかになった。
さらに、10ヶ所の下水処理場において合成エストロゲンのエチニルエストラジオール（EE2）の実態を調査した。HR-GC/MS、LC/MS/MSの機器分析とELISAにより測定したところ流入水、処理水中のEE2濃度は極微量であることが分かった。最も高感度で検出可能なHR-GC/MSによれば、流入水ではすべてnd、処理水ではndから0.28ng/lであった。
キーワード：内分泌かく乱物質、エストロゲン、硫酸抱合体、エチニルエストラジオール、ELISA法、下水処理
3.3 都市排水に含まれるエストロゲン様物質が魚類に及ぼす影響と指標化に関する研究
研究予算：競争的資金
研究期間：平14 ～ 平17
担当チーム：水循環研究グループ（水質）
研究担当者：鈴木穣、宮島潔
【要旨】
河川における魚類の雌性化についてその影響要因を探索するため、河川水質自動監視所を活用して性状変化の生じていない新鮮な河川水を用いた魚類曝露試験を実施した。魚類曝露試験装置の水温調節システムに改良を加え現地試験を行った結果、下水処理水が流入している地点ではエストロンを主体とするエストロゲン作用によって魚類影響が認められた。さらに、降水量によって変動する河川のエストロゲン作用に伴って、魚類影響の程度も変動することが示唆された。
キーワード：エストロゲン、下水処理水、メダカ、雌性化、現地魚類曝露試験装置
研究予算：運営費交付金（一般勘定）
研究期間：平11～平17
担当チーム：材料地盤研究グループ（リサイクル）
研究担当者：尾﨑正明、諏訪守
【要旨】
Cryptosporidiumオーシストの感染能力を迅速かつ簡易に測定するため、細胞培養法による顕微鏡観察およびELISA法の適用性に関し評価を行った。その結果、細胞培養法はマウスによる感染試験法と比較して、迅速かつ簡易に測定は行えるが、顕微鏡観察では１視野で観察されるオーシスト数にバラツキが大きく、また、ELISA法でもセルシート上でのバラツキが吸光度測定に大きな影響を及ぼすと考えられた。ウイルスに関しては、セルロース・吸着凝集法およびポリエチレングリコール法によるウイルス濃縮法の最適化の検討を行うとともに、下水処理過程でのノロウイルスの除去率を求めた。
キーワード：Cryptosporidium、細胞培養法、ウイルス、リアルタイムPCR法
